作者王丽芝 , 浦香东 谭世强，引自《河北农业大学学报》 , 2017 , 40 (2) :67-72

灵 芝 Ganoderma lucidum ( Leyss.ex Fr.)Karst.属于担子菌亚门层菌纲非褶菌目真菌,素有“仙草”之誉｡其干燥子实体入药,具有调节血糖,控制血压,抗衰老,抗肿瘤等生物活性 [1 ] ,已被中国药典和美国草药药典所收录｡研究表明,灵芝含有多糖､三萜､倍半萜等多种生物活性成分 [1 - 3 ] ｡因其具有较好的辅助肿瘤放､化疗功效,一直是药物学家们研究的热点真菌之一｡随着大量具有生物活性和细胞毒性的倍半萜类化合物的发现,如 β - 内酰胺类抗生素､他汀类和环孢霉素等,倍半萜类化合物的研究正在逐步加深｡而担子菌亚门作为萜类化合物的主要生产者之一,往往含有在自然界其他地方观察不到的独特结构 [4 ] ｡

灵芝作为担子菌亚门最具药用价值的真菌,一直被推崇了 2 000多年｡然而,由于其倍半萜类化合物的含量极低,只有很少部分化合物得到了分离和鉴定,如 α - Muurolene ､ γ - Muurolene ､gymnomitrane -3α,5α,9β ,15 - tetrol等[ 5 , 6 ] ,因此,解析灵芝萜类合酶的生物合成途径,获得萜类化合物生物合成相关基因,通过在微生物体内重建其生物合成途径获得高效率生产倍半萜类化合物的手段是发现和生产灵芝倍半萜类化合物极为有效的途径｡

倍半萜合酶(STS )是倍半萜生物合成途径的关键酶(图 1 ),主 要 负 责 催 化 Famesyl diphosphate(FPP )二磷酸的释放,然后引导碳正离子沿着异戊烯链迁移,进而诱导一系列环化和重排反应｡目前,青蒿等 [7 - 11 ] 植物中的倍半萜合酶的研究已有一定进展,但在真菌中的研究较少,仅在 Coprinus   cinereus等 [12 - 13 ] 少数物种中有所描述｡对药用灵芝倍半萜生物合成途径基因的研究尚未见报道｡本研究以灵芝菌丝为材料,克隆一个灵芝倍半萜合酶的基因,并在大肠杆菌中进行异源表达,为后续的功能鉴定及深入研究其生物合成的分子调控机制奠定基础｡

 

 

1  材料与方法

1.1  试验材料

本试验所用灵芝菌种由中国医学科学院药用植物研究陈士林课题组分离获得,所获得的菌丝利用液体 培 养 基 进 行 培 养,收 集 菌 丝,用 液 氮 处 理,-80℃保存备用｡

1.2  试验方法

1.2.1  菌种培养   取含有灵芝单倍体菌丝的 PDA培养 基 2~3 块 接 种 于 液 体 培 养 基 中,于 摇 床(28℃ , 160r / min )上 振 荡 培 养 3~4d ,转 移 至250mL培养瓶(含有100mL液体培养基)继续培养7d ,收集菌丝,置于液氮中速冻｡

1.2.2  灵芝菌丝总 RNA 的提取和基因克隆采用 QiaGen RNeasy  Mini 试 剂 盒 提 取 RNA ,根 据TaKaRa PrimeScript 1st Strand cDNA 说明书合成cDNA ｡根据已经测得的灵芝全基因组数据注释结果调取候选萜类合酶基因cDNA 序列( Gene ID :GL26009 ),使用Primer premier软件进行引物设计扩增候选萜类合酶基因的完整开放阅读框,并在两端分别引入限制性内切酶酶切位点 NcoI和Hin dIII ,引物序列为 GL26009 - F / R : 5′ - caaccATGGCT -GTAACTCCTGC - 3′ / 5′ - cccaagcttCTAGGCATGG -GCGCGC - 3′ ｡以灵芝菌丝cDNA 为模板进行 PCR反应,采用 Pyrobest DNA Polymerase进行扩增,PCR扩增程序为:94℃预变性3min ; 94℃变性30s , 55℃退火30s , 72 ℃延伸90s ,共40个循环, 72℃延伸5min ｡扩增产物切胶回收后连接到PGEM -Teasy 载体上,并转化 E .coli  5α 感受态,结合蓝白斑和菌落PCR挑选阳性转化子并测序｡

1.2.3  灵芝倍半萜合酶基因cDNA 的生物信息学分析   利用 NCBI 数据库对基因 GL26009 序列进行序列相似性分析获得具有完整开放阅读框的基因｡利用 在 线 软 件 ExPASy  Proteomics Server的Prot-param对该蛋白质的理论等电点等进行预测,并应用在线SinalP4.1Server 软件对该蛋白序列中的信号肽进行 分 析,利 用 WOLF PSORT ( http :// wolfpsort.org/)在线工具预测该蛋白的亚细胞定位情况,同时利用 TMHMM 软件对蛋白跨膜结构区分析｡

1.2.4  灵芝萜类合酶 GL26009 基因的外源表达 提取构建成功的基因表达质粒,转化 BL ( DE3 )表达感受态细胞｡将重组菌和未连基因的PET28a分别接种于LB培养基(含有50mg/ L的卡那霉素)中振荡培养｡然后加入IPTG至终浓度0.6mmol /L诱导表达20h ｡收集菌体,然后通过SDS -PAGE进行检测表达情况｡

1.2.5  灵芝萜类合酶 GL26009 基因的功能验证 取过夜培养的含有灵芝倍半萜合酶 GL26009 基因的表达质粒和 PET28a空载体质粒的重组菌分别转接至50mL LB 培养基(含有 50mg/ L 的卡那霉素)中,加入终浓度0.6mmol / L的IPTG ,在30℃下诱导表达 20h ｡采用顶空固相微萃取—气相色谱质谱法测定样品中的倍半萜｡首先,利用顶空固相微萃取法萃取样品中的倍半萜 10min ,然后进样进行分析｡分析条件为:采用 HP - 1 柱( 30m×0.25mm×1.5 μ m)进行分离,以氦气为载气,进样口温度设置为250℃ ,将顶空固相微萃取的纤维头放入进样口,保持 5min ｡柱温 以 8 ℃ / min的 速 率 由 60 ℃ 升 至 250 ℃ ,在250℃保持3min ,扫描质量数范围设为30~300 ｡

2  结果与分析

2.1  GL26009 基因全长 cDNA 的克隆和序列分析根据陈士林课题组的灵芝全基因组测序结果设计引物,以灵芝单倍体菌丝的 RNA 为模板进行反转录合成cDNA 第1 链,再以cDNA 为模板进行PCR扩增,获得一条长1041bp 的序列(图2 ),然后进行切胶回收､连接,利用蓝白斑筛选阳性克隆送至测序公司测序｡测序结果采用 Lasergene SeqMan进行拼接,测序结果与从基因组数据库中获得的序列一致,将该基因命名 为 GL26009 ｡将该蛋白与NCBI和JGI上下载的其他担子菌亚门真菌倍半萜合酶的氨基酸进行 Blast比对,结果显示该基因与灵芝属真菌 Ganoderma sp.10597SS1 [数据来源于JGI ( http :// genome.jgi.doe.gov /)]的倍半萜合酶Gansp158881 的蛋白同源性为 97%,与Ganodermasinense 的 GS02363 (数据来源于 NCBI )蛋白同源性为94% ,与 Ganodermasp.10597SS1 倍半萜合酶Gansp158158的蛋白同源性为 50% ｡使用 DNA -MAN 软 件 将 GL26009 与 Ganoderma   sinense( GS02363 ), Ganoderma  sp.10597 SS1 ( Gan-sp158881 和 Gansp158158 )的氨基酸序列进行多重序列比对(见图 3 ),结果表明相似度为 74% ｡序列比对结果表明,不同物种的倍半萜结构域的组成上有个别差异,但是大部分残基十分保守 [14 ] (见图 3 )｡

 

2.2  灵芝倍半萜合酶的系统进化分析

将该蛋白与 GenBank和JGI上下载的其他担子菌亚门真菌倍半萜合酶的氨基酸进行比对分析,利用 MEGA5.0软件采用相邻连接法构建系统进化树,见图4 ｡从进化树上可以看出,目的蛋白与 Ga -noderma sp.10597SS1的 Gansp158881聚为一支,表明二者具有较高的同源性｡

图4

GL26009 与其它担子菌来源的系统进化关系分析Fig.4 Phylogenetic analysis of  GL26009  and other sesquiterpenoid synthases from basidiomycetes
2.3  灵芝倍半萜合酶的生物信息学分析

根据在线软件 ExPASy  Proteomics Server 的Protparam 对该倍半萜合酶进行预测分析,得到该蛋白相对分子质量 40.52kDa ,等电点为4.97 ,脂肪系数为20.08 ,不稳定系数为 59.55 ,大于 40 ,预测结果 显 示 该 蛋 白 是 一 个 不 稳 定 蛋 白｡应 用 Si -nalP4.1Server 软件对该蛋白序列中的信号肽进行预测,结果表明该基因不具有信号肽序列｡亚细胞定位的预测结果显示其主要存在于细胞质中｡根据TMHMM 软件对蛋白跨膜结构区进行预测分析(图5 ),结果表明该蛋白不存在疏水的跨膜区｡图5

GL26009 蛋白跨膜结构区分析Fig.5 Analysis of transmembrane structure for  GL26009

2.4  灵芝萜类合酶 GL26009 基因的外源表达

将已插入 GL26009 基因的重组质粒和 PET28a的空载体质粒(对照组)分别转化 BL ( DE3 )表达感受态细胞｡将 GL26009 基因的重组菌和 PET28a重组菌分别接种于 LB培养基(含有50mg/ L的卡那霉素)中

振荡培养｡然后分别加入IPTG 至终浓度 0.4 , 0.6 , 0.8 , 1.0mmol / L 诱导表达 20h ,摸索蛋白表达的最佳IPTG 诱导浓度,利用 SDS - PAGE进行分析｡结果表明0.6mmol / L IPTG 诱导时蛋白的表达量最大,故最终选择终浓度为0.6mmol / LIPTG进行目的蛋白的诱导表达,提取粗酶并利用SDS - PAGE进行分析(图6 )｡从图上可以看出,插入 GL26009 基因的重组质粒比空载体多出一条亮带,大小在40kDa

左右,与目的蛋白大小一致,表明成功构建了灵芝萜类合酶基因 GL26009 的原核表达载体,并完成了该倍半萜合酶在大肠杆菌中的异源表达｡

 

图 6  重组 GL26009 的 SDS - PAGE 分析

Fig.6 SDS - PAGE analysis of recombinant  GL26009

2.5  灵芝萜类合酶 GL26009 基因的功能验证

根据2.4获得的结果,本试验采用终浓度0.6mmol / L 的 IPTG 进 行 目 的 蛋 白 的 诱 导 表 达,在30℃下诱导表达20h ｡由于灵芝中萜类化合物含量极低,常规提取方法获得的量极低或无法获得,本试验采用顶空固相微萃取—气相色谱质谱法测定样品中的倍半萜｡首先,利用顶空固相微萃取法萃取样品中的倍半萜 10min ,然后按照 1.2.5 中的条件进行 分 析,所 获 得 的 质 谱 数 据 见 图 7 ｡ 只含 有PET28a空载 体 的 样 品 (对 照 组)未 出 现 峰,含 有GL26009 基因的重组质粒的反应样品的质谱图见图7a ｡分别将 A､B化合物的保留时间和质谱图与已发表的化合物进行比较,其保留时间和质谱图与文 献 报 道 的 一 致 [12 - 13 ] ,初 步 确 定 倍 半 萜 合 酶GL26009 催化生成 2 个倍半萜类化合物 γ - Muur -olene(图 7b,主要的碎片离子峰为 204 , 161 , 119 ,105)和α - Muurolene(图7c,主要的碎片离子峰为204 , 161 , 105 )｡

a. GL26009 粗酶样品的全波长扫描图  b.A 化合物的质谱图c.B 化合物的质谱图｡
 

图 7  重组 GL26009 酶催化产物的 GC - MS 分析

Fig.7 GC - MS analysis of enzymatic reaction product ofrecombinant  GL26009

3  讨论与结论

   倍半萜类化合物作为中草药次生代谢产物的一个重要分支,含有很多功效显著的成分,如对恶性疟疾有速效作用的青蒿素,抗癌活性良好的倍半萜类衍生物紫杉醇等 [15 - 17 ] ｡担子菌亚门真菌作为倍半萜类化合物的主产者之一,含有很多结构丰富的倍半萜类化合物｡而灵芝作为担子菌亚门中最具药用价值的真菌,一直备受关注｡目前对灵芝倍半萜类化合物的研究主要集中在化学成分分析及药理等方面,而对其生物合成及调控机制的研究相对缺乏｡

随着对灵芝倍半萜类化合物研究的逐步深入,许多具有很好的生物活性物质逐步被发现,如 gym -nomitrane -3α,5α,9β ,15 - tetrol 等[ 6 ] ｡但是由于担子菌中倍半萜类成分含量普遍偏低,常规提取分离方法的收率较低,其进一步的研究受到很大的限制｡

倍半萜合酶作为倍半萜化合物生物合成途径中的关键酶,能够催化其前体 Famesyl diphosphate ( FPP )发生一系列的环化和重排反应形成具有独特结构的倍半萜｡因此倍半萜合酶的深入研究对提高倍半萜类化合物的产量极为重要｡本研究克隆到一个全长为 1 041bp 的倍半萜合酶基因,编码 346 个氨基酸｡

研究结果表明其与JGI发布的灵芝属真菌 Gano -derma sp.10597SS1 中催化生成 γ - Muurolene 的倍半萜合酶 Gansp158881 相似度较高,二者具有较高的同源性｡多重序列比对的结果显示不同的担子菌真菌中倍半萜合酶的保守结构域存在个别的差异,而不同 物种中 该 酶 催 化 生 成 的 产 物 也 不 完 全 相同 [12 , 13 ] ,这可能是担子菌中倍半萜化合物结构丰富的一个原因｡

通过基因工程手段改变次生代谢产物合成途径中关键酶基因的表达水平来达到提高某种次生代谢物的产量的目的文章已有报道｡在青蒿中过量表达法尼基焦磷酸合酶基因可以使青蒿素的含量提高4倍 [17 ] ｡如果在灵芝中提高倍半萜合酶基因的表达量,就有可能提高倍半萜的含量｡但是目前灵芝的转基因体系还不成熟｡因此,通过大肠杆菌进行异源表达来达到提高灵芝倍半萜含量的方法是首要的选择｡本研究首次从灵芝菌丝中克隆到一个倍半萜合酶候选基因 GL26009 ,并实现了其在大肠杆菌中的异源表达, GC - MS结果显示重组的倍半萜合酶具有很好的催化活性,为进一步提高倍半萜的含量奠定了基础｡同时研究中发现,该酶除了催化 FPP 生成目的倍半萜 γ - Muurolene和 α - Muurolene外,还产生了其它的倍半萜｡因此,对于灵芝倍半萜合酶功能的研究尚需加强,其家族成员之间的联系以及催化产物的多样性机制还有待进一步探索,这对于研究倍半萜类活性成分次生代谢具有重要意义｡

 

 

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